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      給您一雙鑒別支原體污染的慧眼

      發布時間:2023-04-03      點擊次數:484

      很多小伙伴都疑惑,細胞被支原體污染后的特征是什么?如何鑒別細胞被支原體污染了?今天,我帶大家分享兩個支原體污染的案例,共同探尋一下細胞被支原體污染后的特征。


      圖1 感染支原體的EBTr(牛胚氣管細胞)

       

      先來觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細胞(圖1),由成纖維樣逐漸變得類上皮樣;質膜鋪展,潰爛;輪廓不清,邊界模糊。再看右圖,細胞處于邊增殖邊凋亡的狀態,漂浮凋亡細胞過多。


      圖2 感染支原體的HT1080(人纖維肉瘤細胞)

       

      接下來再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細胞HT1080(圖2),由上皮樣逐漸變得類成纖維樣,胞體細長,和前面的牛胚氣管細胞形態變化剛好相反;偽足伸長,出現明顯的拉絲現象,表明細胞可能在“痛苦"地遷移。使用了支原體殺除試劑(abs9375),清除了支原體以后,如右圖所示,細胞逐漸恢復了上皮樣形態,拉絲減少。


      圖3 細胞膜上的支原體集落

       

      接下來,給大家展示貼附在細胞膜上的支原體集落(圖3),支原體是目前已知最小的原核生物,直徑大小在0.1-0.3um,比細菌還要小。支原體可在培養液、細胞膜、細胞內增殖。單個支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態,圖中膜上的黑點為支原體集落。細胞背景干凈,形態沒有大的變化,但質膜粗糙,布滿黑點。

      總結下來,細胞被支原體污染的主要特征如下:

      ? 增殖減慢;

      ? 上清液澄澈;

      ? 背景干凈;

      ? 細胞形態異常(拉絲、鋪展);

      ? 更換新的培養液細胞狀態沒有恢復。

       

      細胞被支原體污染后的共性表現為細胞增殖減慢、上清液澄澈、背景干凈,這3點可以明確地排除真、細菌污染。值得一提的是,當給細胞的營養體系不佳時,細胞也會表現出形態異常,所以,我們可以給細胞更換新的培養液,如果細胞也沒有恢復正常形態,此時判斷細胞極有可能被支原體“附身"了。

      上述的判斷方法需要豐富的經驗積累,日常細胞培養中,我們還可以用PCR擴增試劑盒檢測細胞是否有支原體污染。


      圖4 支原體檢測試劑盒(PCR法)

      產品優勢:

      ? 本試劑盒檢測靈敏度高,可檢測低至20個拷貝的支原體;

      ? 實驗時間短,3小時即可完成;

      ? 已在多個支原體品種上做過驗證。


      表1 產品組分表

      組分名稱規格
      AMycoplasma PCR Mix(2x)1ml
      BMycoplasma Primer Mix100ul
      CPositive Control50ul
      DMycoplasma Free Water1ml


      該試劑盒檢測到的支原體類別主要有:

      M.fermentans(發酵支原體)、M.hyorhinis(豬鼻支原體)、M.arginini(精氨酸支原體)、M. Orale(口腔支原體)、M.hominis(人型支原體)、M.bovis(牛支原體)、M.pneumoniae(肺炎支原體)、M.pirum(梨支原體)、M.gallisepticum(雞毒支原體)、Ureaplasma spp(解脲支原體)、A.laidlawii(萊氏無膽甾原體) 等11種以上支原體。

      作用原理:

      試劑盒使用的混合引物是針對支原體16s rRNA序列的保守區域設計的特異性引物,可直接使用細胞培養液作為PCR模板,特異性擴增支原體DNA。

      支原體檢測試劑盒(PCR法)使用方法

      1、樣品準備

      取適量待檢細胞培養上清于潔凈的PCR管中(如果是血清樣本,可用 Mycoplasma Free Water 稀釋),利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板;

      2、PCR體系配制

      每次實驗需設置陰性對照(將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water)與陽性對照(在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為Template),實驗時戴一次性口罩與手套,謹慎操作,防止操作不當引入外源支原體污染;

      3、PCR程序設置


      表2


      StepTemperatureTimeCycles
      Initial Denaturation98℃2 min1
      Denaturation98℃20S 
      Annealing56℃25S30
      Extension72℃10S 
      Final extension72℃5min1
      Hold4-16℃Forever 












      4、凝膠電泳

      取10μL PCR產物,使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;

      5、結果分析

      每次實驗通過與陰性對照、陽性對照檢測結果比較確認樣品支原體污染情況,陽性條帶大小500bp左右。如陰性對照檢測結果中有條帶很有可能是PCR體系中出現污染,建議重新實驗確認結果。如有必要,也可對PCR產物進行常規測序,以確定具體的支原體種屬。

      如果您的細胞真的“中鏢"了,也不要怕,我們的支原體殺除試劑為您的細胞披荊斬棘,保駕護航。


      圖5 支原體清除劑(abs9375-200uL×5)


      產品優勢:

      ? 特異性清除培養基中的支原體;

      ? 只需要3-6天,便可以有效清除支原體;

      ? 活性成分為多肽類,不會產生耐藥性;

      ? 對細胞幾乎無毒性,在100多種細胞上進行過驗證,包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等;

      ? 廣譜性,可替代雙抗,可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌;

      ? 可直接加入血清、培養基中,用于清除支原體污染;

      使用方法:
      1、收到貨后,將試劑管瞬時離心(3000rpm,3~5s)保存。
      2、推薦稀釋比例為1:1000。例如10mL的培養基加入10μL的Treatment混勻。

      3、棄去舊的培養基,用PBS將細胞清洗干凈,再加入含有支原體清除劑的新鮮培養基,1天1次, 連續處理3天;或者2天1次,連續處理5~6天。若細胞污染非常嚴重時,需延長處理時間。
      4、若細胞對支原體清除劑敏感,或生長明顯被抑制時,請參考以下推薦參數。


      表3

       大部分細胞部分敏感細胞少部分極敏感細胞
      稀釋比例1:10001:20001:3000
      處理時間3天6天10天

       




      5、處理完畢后,加入新鮮培養基,培養基中可添加支原體預防劑(abs9376)預防支原體再次污染。

       

      本期講解就到這里了,如有細胞培養問題,歡迎微信公眾號后臺留言,或者掃描下方二維碼加入我們微信群交流~


      注:圖源網絡和客戶,僅供參考學習用

       

      表4 細胞培養類產品推薦

      貨號

      品名

      規格

      abs981

      胎牛血清(特級)

      500ml

      abs972

      胎牛血清(優級)

      500ml

      abs974

      胎牛血清(標準級)

      500ml

      abs9483

      高糖DMEM培養基

      500ml

      abs9484

      RPMI-1640培養基

      500ml

      abs9505

      MEM培養基

      500ml

      abs9506

      α-MEM培養基

      500ml

      abs9554

      Ham's F-12培養基

      500ml

      abs9563

      Ham's F-12K培養基

      500ml

      abs9561

      DMEM/F-12培養基

      500ml

      abs962

      PBS緩沖液

      500ml

      abs970

      D-PBS緩沖液(不含 Ca2+ Mg2+

      500ml

      abs971

      D-PBS緩沖液(含 Ca2+ Mg2+)

      500ml

      abs9257

      Hanks平衡鹽溶液(不含 Ca2+ Mg2+)

      500ml

      abs9258

      Hanks平衡鹽溶液(含 Ca2+ Mg2+)

      500ml

      abs47014938

      胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) ,含酚紅

      100ml

      abs47047375

      胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%),不含酚紅

      100mL

      abs9479

      無DMSO無血清細胞凍存液

      100mL

      abs9417

      無血清細胞凍存液

      100mL

      abs9473

      細胞凍存液(含血清)

      100mL

      abs9474

      組織保存液

      100ml

      abs9480

      組織凍存試劑盒

      30ml

      abs9486

      模具

      1個/套

      abs9487

      小刀

      5片/包

      abs9481

      組織復蘇試劑盒

      50ml

      abs42020125

      卡那霉素B硫酸鹽

      250mg

      abs42018967

      硫酸慶大霉素溶液

      10ml

      abs9244

      青鏈雙抗

      100ml

      abs9245

      青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液

      100ml

      abs42013298

      兩性霉素B

      1g

      abs44071148

      制霉菌素

      1g

      abs9246

      青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液

      100ml

      abs9252

      支原體檢測試劑盒

      100T

      abs9375

      支原體清除試劑

      200uL×5

      abs9376

      支原體預防

      500uL×4

      abs816578

      環丙沙星鹽酸鹽

      500mg

      abs9374

      水盤抑菌劑

      20ml

      abs9371

      水浴鍋抑菌劑

      100ml

      abs9372

      培養箱除菌劑

      480ml

      abs9373

      細胞房除菌劑

      480ml


      Absin特色產品線:

      WB相關:ECL發光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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