實驗操作 | 免疫組化(IHC)操作步驟+注意事項！

大家好！今天我們來聊聊免疫組化(IHC)實驗的操作流程。IHC是一個超級強大的技術，能夠讓你在組織切片中找到特定的蛋白質。跟我來，我們一步步搞定它，讓實驗變得輕松愉快！

IHC實驗流程：通常包括樣本固定、包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復染、封片觀察12個部分。

1、樣本固定

目的：確保組織樣本的質量和完整性，為后續的免疫染色打下堅實基礎。

操作步驟：

1）取材：從動物或人體取得所需的組織樣本。對于組織塊，要確保其大小適中，不宜過大，以便于固定液能夠充分滲透；

2）初步處理：如果組織樣本帶有血液或其他體液，應先用生理鹽水或PBS進行沖洗，以去除這些可能影響固定效果的物質；

3）固定：將組織樣本放入固定液中。常用的固定液有4%多聚甲醛溶液(abs9179)，冰凍切片/神經組織可以使用OCT包埋劑(abs9756)固定液的量通常為組織體積的10-20倍，以確保組織能夠充分浸入固定液中。大組織標本應切開固定，以免中間部分自溶解腐敗。

 注：固定時間根據組織類型和實驗要求而定，一般固定時間室溫18-24h。

4）固定后的處理：固定完成后，將組織從固定液中取出，用流水沖洗數分鐘，以去除殘留的固定液和可能產生的結晶。

注意事項：

固定的時間不宜過長，以免導致組織過度硬化和抗原性的喪失；

固定的溫度通常為室溫或 4°C，避免高溫導致組織損傷；

在固定過程中，要確保組織樣本wan全浸入固定液中，避免出現未固定的部分；

固定的容器應干凈、無雜質，避免對組織造成污染。

2、包埋

目的：保護和支撐組織樣本，以便在切片時保持其完整性。通過將組織樣本嵌入到固體介質中，可以制作出適合在顯微鏡下觀察的薄切片。

根據樣本類型可以分為石蠟切片免疫組化(IHC-P)和冰凍切片免疫組化(IHC-F)，石蠟切片免疫組化雖然操作更加復雜，但其可以更好的保持組織的形態結構，厚度更薄便于染色和觀察，以及可以常溫保存多年的優點，在實驗中更為常用。

基本步驟：

1）脫水：在組織樣本固定后，需要將其中的水分去除，以便于包埋介質能夠充分滲透。酒精梯度脫水：75%乙醇(1h)——85%乙醇(1h)——95%乙醇(1h)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)

2）透明：脫水后，組織樣本會變得不透明，需要使用透明劑（如二甲苯）來去除其中的酒精和其他溶劑，使組織樣本變得透明。通常用二甲苯浸泡：二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)

3）浸蠟：將透明后的組織樣本放入熔化的石蠟中，讓石蠟充分滲透到組織樣本中。這個過程通常需要在溫箱中進行，以確保石蠟的均勻滲透：63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)

4）包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具中，倒入熔化的石蠟，然后讓石蠟冷卻凝固。這樣，組織樣本就被包埋在石蠟中了。

注意事項：

在包埋過程中，要控制好溫度和時間，以確保石蠟的均勻滲透和組織的完整性。

包埋后的組織塊需要冷卻凝固后才能進行切片。在冷卻過程中，要避免過度冷卻導致石蠟碎裂或組織變形。

在包埋前，要對組織樣本進行充分的固定和脫水處理，以確保其抗原性和完整性。

3、切片

目的：將包埋后的組織樣本切割成薄片，以便于在顯微鏡下觀察和檢測。

基本步驟：

1）切片前的準備：確保包埋后的組織塊已經充分冷卻并固化。使用適當的切片機進行切片；

2）切片：將包埋好的組織塊固定在切片機的樣本夾上。調整切片機的切片厚度，通常為4-5微米厚，這個厚度是根據需要檢測的抗原和實驗要求來確定的；

3）展片：使用刷子或毛筆輕輕地將切好的組織切片從刀上取下，并放在溫水(40℃)中展開；

4）烤片：60℃烤片2h。

注意事項：

在切片過程中，要控制好切片機的速度和切片刀的鋒利度，以獲得高質量的切片。

切片后，要及時對切片進行處理，以避免抗原的損失和組織的變性。

使用適當的黏貼劑，確保切片牢固地附貼在載玻片上，以便于后續的免疫組化實驗。

4、脫蠟水化

目的：將組織切片從石蠟中釋放出來，并使其恢復到適合進行后續抗原檢測和染色的狀態。

基本步驟：

1）脫蠟：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蠟。將切片放置于切片架內：二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)

2）水化：100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去離子水(5min)

注意事項：

徹di脫蠟：脫蠟過程必須徹di，以確保石蠟被wan全去除。否則，殘留的石蠟會影響后續的抗原檢測和染色。

避免干燥：在整個脫蠟水化過程中，應確保切片始終保持在濕潤的狀態，避免干燥。干燥會導致非特異性抗體結合，從而出現高背景染色。

5、抗原修復

目的：通過修復過程暴露被固定時隱藏的抗原表位，提高抗體的結合效率。zui常用的修復緩沖液是10mM的pH6.0檸檬酸鈉(abs9248)、pH9.0的Tris-EDTA(abs9342)、pH8.0的EDTA。建議測試多種方法以尋找染色效果好的方法。

抗原修復的方法：

1）微波熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于微波爐中火8min，?；?min，轉小火8min；取出染色盒，冷卻至室溫；

2）水浴熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于水溶鍋中加熱，其間不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效度(92℃)，維持40min后取出染色盒，冷卻至室溫；

3）高壓熱修復：在染色盒中加入抗原修復液，放入切片，置于高壓鍋內加熱至飽壓后繼續加熱5min，關閉電源，10min后取出染色盒，冷卻至室溫；

4）酶解修復：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當的溫度和濕度條件下進行酶解（通常為37°C，20min）。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續處理。

注意事項：

加熱后需自然降溫；

使用過量的抗原修復液；

修復液的不同pH值對染色結果的影響比較大；

沒有一種抗原修復緩沖液可以適用于所有抗原。不同的抗體可能需要不同的抗原修復方法和條件，因此需要根據實驗要求和抗體特性選擇合適的抗原修復方法。

6、滅活

目的：消除細胞或組織中內源性酶和活性物質的影響，降低背景噪音，提高實驗的特異性和敏感性。

1）滅活內源性過氧化物酶：HRP檢測系統，常用的去除內源性過氧化物酶的方法是3%過氧化氫水溶液，室溫10min；

2）洗滌：用PBS或TBS等緩沖液洗滌切片、浸泡2次，5min/次。

 注意事項：

H₂O₂需現用現配，且4℃避光保存，否則易引起非特異背景；

H₂O₂孵育時間過長也會易引起脫片；

部分組織還含有內源性堿性磷酸酶，可用左旋咪唑進行滅活。

7、封閉

目的：封閉組織切片上非特異性結合位點，防止抗體與這些位點結合，從而減少背景信號。

基本步驟：

1）非特異位點封閉：將封閉液 （如abs933山羊血清）滴加到組織切片上，確保封閉液均勻覆蓋整個組織區域。然后將切片放入濕盒中，在室溫或37°C下孵育30min，讓封閉液與組織切片充分作用。

2）洗滌：封閉結束后，用PBS或TBS等緩沖液洗滌切片，以去除未結合的封閉液和可能存在的雜質。

8、一抗孵育

免疫組化中的一抗孵育是免疫組化實驗的關鍵步驟之一。

目的：特異性識別目標抗原，為后續的檢測提供準確標記。

基本步驟：

1）選擇一抗：根據實驗目的選擇特異性高、親和力強的一抗。一抗應該與目標抗原的種屬來源、類型等相匹配；

2）稀釋一抗：根據一抗的效價和實驗要求，用適當的稀釋液如PBS、TBS等（或abs9299抗體稀釋液）稀釋一抗；

3）涂覆一抗：將稀釋好的一抗均勻涂覆在已封閉的組織切片上，確?？贵w能夠充分接觸組織切片上的抗原；

4）孵育：將稀釋好的一抗均勻滴加在已封閉的組織切片上，放入濕盒中，室溫 (或37°C) 孵育1h，使一抗與抗原充分結合。

注意事項：

確保一抗的質量和特異性，避免使用過期或質量不佳的一抗；

充分洗滌組織切片，去除未結合的一抗和其他雜質，減少背景染色。

9、二抗孵育

目的：二抗的作用是與一抗結合，形成抗原-抗體-抗體復合物，從而增強信號的強度和特異性。

在免疫組化實驗中，二抗通常帶有標記酶 (如HRP.AP等)，這些標記物在后續的顯色步驟中可以產生可見的染色信號，便于在顯微鏡下觀察目標抗原在組織中的分布和表達情況。

二抗孵育的基本步驟：

1) 稀釋二抗：參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液或其他適當的溶液稀釋二抗；

2) 孵育二抗：將稀釋好的二抗滴加在已經過一抗孵育并洗滌的組織切片上，室溫孵育30min-60min。

3) 洗滌：孵育完成后，使用洗滌液（如PBST或TBST）在搖床上緩慢搖動洗滌切片，以去除未結合的二抗和其他雜質。洗滌通常需要重復幾次，每次洗滌時間一般為5-10min。

10、顯色反應

目的：顯色檢測中需要考慮的其他因素有酶和顯色底物的選擇。每種檢測酶都有幾種不同的顯色劑，HRP-DAB是zui常用的顯色劑組合。

原理：在免疫組化中通常使用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)等作為標記酶。這些酶能催化底物發生顏色反應，從而在抗原所在的位置形成可見的沉淀物。

基本步驟：

1）加入酶的底物（如HRP的底物為DAB，AP的底物為BCIP/NBT）。

2）底物在酶的作用下發生化學反應，形成有色沉淀物，通常呈現棕色（對于HRP-DAB系統）或藍色（對于AP-BCIP/NBT系統）。

3）密切觀察切片顯色程度和顯色時間，一般為3-8min，及時用蒸餾水洗脫，防止顯色過深。通過顯微鏡觀察組織切片上的顏色變化，可以確定抗原在細胞或組織中的位置和表達水平。

注意事項：

DAB工作液現用現配

選擇適當的檢測系統：根據實驗目的和樣本特性選擇合適的檢測系統；

優化條件：對一抗、二抗的濃度、孵育時間和溫度等條件進行優化，以獲得最佳的檢測結果；

注意防護：DAB為聯苯偶氨化合物，可誘發皮膚癌和膀胱癥，在顯色操作過程中需注意防護。

11、復染

目的：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可進行復染。

復染：滴加80-100μL蘇木素染色液至wan全覆蓋組織，室溫孵育5min，1%鹽酸酒精分化1s，自來水稍洗，自來水返藍5min。

注意事項：

復染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關；

如果染色過淺可重復染色，如果染色過深可使用鹽酸進行分化。

12、封片觀察

目的：在免疫組化實驗中，封片觀察是最后的步驟，用于保護組織切片、增強對比度和穩定性，并允許在顯微鏡下進行長期觀察和分析。

封片步驟：

1）脫水：在完成所有染色步驟后，通常需要將組織切片進行脫水處理，以去除切片上的水分。切片依次使用70%、85%、95%乙醇、無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ分別浸泡1min。

2）透明：脫水后，切片需要進行透明處理，以便封片劑能夠均勻分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡兩次，每次1min。

3）封片：將一滴封片劑（如中性樹膠abs9177）滴在組織切片上，然后用蓋玻片輕輕覆蓋。封片劑的選擇取決于實驗要求和標本類型。封片時要確保沒有氣泡產生，并且蓋玻片與切片之間緊密貼合。

4）干燥：讓封片劑自然干燥，或者可以在溫箱中加速干燥過程。干燥后的切片可以長期保存，并隨時用于觀察。

希望這份IHC實驗操作流程指南能幫助您在實驗中取得令人滿意的結果！如果有任何問題或需要進一步的幫助，請隨時聯系愛必信生物，我們隨時為您提供支持。

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