CoIP實驗常見問題

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過捕獲與蛋白或抗原特異性結合的抗體，進而從復雜的樣品中捕獲及富集目標蛋白，同時可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。

CoIP原理圖

CoIP實驗對照的設置方法

常見的主要有三種方式：

1）第一種是實驗組轉染誘餌蛋白和標簽蛋白，對照組只轉染標簽蛋白，這種方法不僅可以提高誘餌蛋白的表達量，增加實驗的成功率，而且標簽抗體的成本低，親和力強，但是畢竟不是本身生理狀態下的表達量，和實際結果可能有出入，而且需要構建載體，更適用于誘餌蛋白表達量低或者沒有IP抗體的情況；

2）第二種是選擇IP抗體的對照IgG抗體，這種方式下，誘餌蛋白的表達處于天然狀態，更接近真實情況，但是相應的可能出現表達量低，成功率不高的情況，同時需要IP級別的抗體；

3）第三種就是用敲除誘餌蛋白的細胞作對照樣本，這種情況下，實驗組也是在天然條件下，可信度高，但是實驗所需的周期較高，要進行敲除驗證。

1、CoIP試劑盒中樣本裂解液可以用WB的裂解液替代嗎？

不可以，CoIP的裂解液中一般不含SDS，SDS是一種強效的去垢劑，它能夠破壞蛋白質之間的非共價相互作用，使蛋白質變性，這會導致原本相互作用的蛋白質復合體解離。

2、COIP樣本裂解后蛋白濃度一般能達到多少？

不低于1mg/mL，如果蛋白濃度過高，可用pbs稀釋。

3、瓊脂糖珠中Protein A和Protein G有何區別，都要加嗎？

一般建議都加，Protein A與兔源抗體親和力高，Protein G與鼠源抗體親和力高。

4、抗體、樣本、磁珠的加入順序比較？

第一種抗體先于蛋白結合，再加入磁珠，第二種抗體先與磁珠孵育，最后加入蛋白，第三種同時加入，一般情況下第一種與第二種相差不大，如果蛋白量過高，比如大于1000ug，建議使用第二種，否則蛋白容易吸附在磁珠上，降低得率。

5、Input組要跑內參嗎？

當然，Input組跑內參不僅可以協助判斷操作，對樣本是否降解也有提示作用。

IP/CoIP結果判讀及常見問題

1、CoIP結果如何判讀？

IB：即免疫印跡，也就是常規的Western Blotting，用于顯示目的蛋白；

IP：即免疫沉淀，這一步主要是為了純化富集目的蛋白；

Input：全細胞裂解液，含有細胞內所有的蛋白，可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞裂解液，在做IP實驗之前，需要先跑WB，確認樣本中含有蛋白A和蛋白B；

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體；

IgG：Anti-A的同型對照抗體，即跟Anti-A同來源同種型，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG(abs20035)。

結果圖解析：

該結果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組：Input組及IP組，其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實驗組，并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗，結果蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結合，排除了蛋白與抗體非特異性結合的可能性；而實驗組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時蛋白B也被沉淀下來，進而得到結論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。

2、input組無條帶，IP組有條帶

可能由于目標蛋白在樣本中的豐度較低或存在降解現象，這導致在Input組中未能成功檢測到該蛋白，而在IP組經過富集后能夠檢測到。建議適當提高Input組的上樣量，進行常規的WB驗證，并在樣本處理階段添加蛋白酶抑制劑以穩定蛋白質。

3、雜帶問題

非特異性條帶要分情況分析，如果是input和IP組、IgG組都有雜帶，可能是磁珠的非特異性結合，樣本上樣量過高、或者抗體濃度過高造成的非特異性結合，建議實驗前對磁珠進行漂洗，實驗過程中增加洗滌次數，使用合適的樣品和抗體濃度。如果IgG組和IP組無雜帶，Input有雜帶，可能由于WB抗體的特異性不夠好，實際實驗中可能考慮的因素可能要更多。

4、IP和IgG組均無條帶

可能由于IP抗體加入的量少，ip抗體特異性差，或者蛋白量過高，優先覆蓋住beads，導致IP抗體和Beads的集合較少等，可以優先通過增加抗體用量和優化結合順序入手，實在沒有改善只能更換抗體進行嘗試。

5、輕重鏈問題

在變性洗脫過程中，抗體在高溫和還原劑的影響下分解為重鏈55KD和輕鏈分子25KD，當WB所用的抗體和IP抗體同源時，二抗就會識別到IP抗體的輕重鏈，這是比較常見的一個問題，在抗體選擇時，盡量IP抗體和WB抗體來自不同種屬，當然，即便已經做了這種優化，實驗結果往往還是有輕重鏈，可能是由于二抗的特異性不夠等原因，這種情況下可以采用IP專用的二抗，這種抗體只識別輕鏈或者重鏈，如果目的蛋白在輕鏈附近，選擇只識別重鏈的抗體，或者對于WB實驗，建議使用直標一抗，但需注意直標一抗可能因無二抗信號放大作用，而導致信號較弱或無法曝光的情況。

注：本文圖片來源于網絡，僅供學習參考用

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