人正常腸類器官培養基

描述：

人正常腸類器官培養基可應用于人正常腸來源類器官的常規培養傳代，能夠保持其傳代后的生長活力，類器官培養過程中，不用添加任何其他蛋白因子。

使用方法：

1、原代 
（1）取材后的組織放在預冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離，拍照并登記信息。
（2）準備若干培養皿，加入 4℃預冷的人正常腸類器官組織原代培養緩沖液#abs9731備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養皿中，利用人正常腸類器官組織原代培養緩沖液清洗三次后，利用眼科剪或手shu刀將組織jian切成體積約為 1-3mm3的組織塊。
（4）組織用消化液#abs9749消化，4℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后，加入三倍體積人正常腸類器官組織原代培養緩沖液終止消化。
（6）使用100um孔徑的篩網進行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加人正常腸類器官組織原代培養緩沖液重新重懸離心。
（7）基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠#abs9495 重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加人正常腸類器官培養基（恢復室溫）進行培養。

2、類器官傳代培養
（1）移液槍吸去培養基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養緩沖液#abs9730放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）a：類器官數量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清，添加適量人正常腸類器官傳代培養緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
         b：類器官數量較多或體積較大時：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液#abs9520 消化2-3min，添加人正常腸類器官傳代培養緩沖液終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量人正常腸類器官傳代培養緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15min添加500ul人正常腸類器官培養基。

3、類器官凍存
（1）移液槍吸去培養基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養緩沖液放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量人正常腸類器官傳代培養緩沖液再次重懸，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液#abs9519，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存。

4、類器官復蘇
（1）取10ml人正常腸類器官傳代培養緩沖液于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量人正常腸類器官傳代培養緩沖液重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15min成膠，添加500ul人正常腸類器官培養基。